对于德国海登堡大学的学者们来说，这个谜团已经在2005年解开了。当时，有人在一本1503年的书中发现了手写的旁注，这本书的主人是达芬奇的一个朋友。这些注释表明达芬奇正在为“丽莎·德尔·乔康多”画肖像。
但是一本书中的潦草笔迹不太可能使那些持其他观点的人信服。即使有越来越多的证据表明这个女人是达芬奇富有邻居的妻子，未来的人们很可能仍会继续质疑这个男人或者女人的身份，直到发现十分确凿的重要证据。如果画中人被证明真的是盖拉蒂妮，那么这一证实可能只会引起更多的问题，假设这幅画像是商人委托达芬奇而画的，那么为什么他从未收到过他妻子的画像呢?人们认为达芬奇于1503年开始创作这幅画，并且持续了许多年。大概有十年时间，他一直将这幅画随身携带，时不时填上几笔。
其实，这幅16世纪的杰作并没有交到商人乔康多的手里。达芬奇受到法国国王弗朗索瓦一世的邀请，到其位于安博瓦兹的城堡附近的吕赛庄园工作。后来，国王购得了这幅画。这幅在杨木上创作的小画像一直以来都是法国的国宝，并且是世界上人们最熟知的画像之一。它被罩上防弹玻璃，挂在巴黎的卢浮宫里。每年都有600多万人来观赏这幅画作。
画像主人公的身份不是《蒙娜丽莎的微笑》背后的唯一谜团，这幅画已经永远和“神秘莫测”这个词联系在了一起。达芬奇采用他自学的“无界渐变着色法”技巧混合多种颜料来作画，特别着重渲染了主人公的眼角和嘴边。人们认为，这种技巧创造出了一种“神秘微笑”的幻像，根据观察者位置的不同，这微笑会时隐时现，若有似无。观察者的视线从主人公的眼睛转移到嘴角需要几纳秒，微笑似乎就在这一瞬消失了。
过去的十年中，在这幅画创作500周年之际，人们对其进行了激光扫描和红外光检测，并采用数字技术对其进行了剖析，为的是找出一些可能隐藏其中的秘密。在麻省理工学院的期刊《雷昂纳多》上，物理学家迪奥戈·奎罗斯·康德用科学方法对这一现象进行了研究。他解释说，主人公眼睛和嘴周围层层的混合颜色同人的眼睛开了一个玩笑。当人眨眼的时候，少量光过滤到视网膜内。根据光亮度的不同，眼睛会看到多种颜色的不同组合。记住，艺术家达芬奇同样具有科学家的头脑，或许他是有意将蒙娜丽莎的微笑画得忽隐忽现的。
为了从这幅画及其不寻常之处获得更多的信息，研究人员还进行了其他的实验。数字分析发现，达芬奇的面部特征同画中这位女士的面部特征几乎完全一致。这足以使至少一位研究者相信，事实上这幅画是达芬奇刻意掩饰的自画像。
为了更科学地判定《蒙娜丽莎》更多的信息，2005年荷兰阿姆斯特丹大学的研究人员使用了“情绪识别”软件来判断主人公的情绪。这一技术由阿姆斯特丹大学和伊利诺伊大学联合研制，并在伊利诺伊大学厄本那香槟分校进行了测试。结果发现，这一变幻莫测的微笑中带有83%的喜悦，9%的厌烦，6%的恐惧，2%的愤怒和1%的无情绪，但没有惊讶的情绪。
其他测试已经断定达·芬奇最初画的蒙娜丽莎穿着一层薄纱衣，紧紧抓着她所坐的椅子的扶手，似乎要从椅子上起身。
其他研究人员仍对画的背景感到困惑，甚至已经开始推测达·芬奇创作的画中还有其他的图像，这和孩子们在做Highlights2杂志上的智力游戏时寻找隐藏的图画差不多。
美国业余画家罗恩·皮西里欧在观察达芬奇的名画《蒙娜丽莎》时，破解了一个隐藏500年的秘密——油画里隐藏着一系列动物头像，包括狮子、猿猴、水牛和鳄鱼。